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Nat Comm 欧阳松应课题组发表CRISPR-Cas13d最新研究成果

发布时间:2019-07-26 02:04 来源:未知 编辑:admin

  图1. UrCas13d-crRNA二元复合物的结构示意图.(a)UrCas13d各结构域分布;(b)crRNA二级结构的示意图;(c)二元复合物的三维结构示意图;(d)二元复合物各结构域的表面示意图;(e)crRNA重复区域中五水合镁离子及其周围核苷酸的电子密度图;(f)五水合镁离子与其周围核苷酸、氨基酸残基之间相互作用的细节信息;(g)UrCas13d及其突变体对靶RNA切割的尿素变性凝胶电泳检测结果;(h)四水合镁离子及其周围氨基酸残基的电子密度图;(i)四水合镁离子与其周围氨基酸残基、核苷酸之间相互作用的细节信息;(j)二价金属离子或EDTA存在情况下,UrCas13d加工pre-crRNA的尿素变性凝胶电泳检测结果;(k)二价金属离子或EDTA存在情况下,UrCas13d对靶RNA切割的尿素变性凝胶电泳检测结果。

  CRISPR-Cas系统是原核生物中存在一种规律成簇的间隔短回文重复DNA序列。CRISPR-Cas系统表达的非编码RNA(CRISPR RNA,crRNA)及其相关蛋白(CRISPR associated protein, Cas)组成的复合物使得原核生物能够识别并且抵御外源核酸物质的入侵。CRISPR-Cas系统主要分为两类,它们各自又由多个类型及亚型组成。第二大类CRISPR-Cas系统中的II型CRISPR-Cas9系统和V型CRISPR-Cas12a(Cpf1)系统,已经广泛并高效地应用于多种生物的基因组编辑。Cas9可以纠正个体细胞内的基因缺陷,已经从实验室研究阶段进入到临床研究阶段,具有治愈或预防多种人类疾病的潜力;然而,Cas9系统和Cas12a系统主要负责编辑DNA。针对RNA的编辑工具可以在RNA水平调节基因的功能,而不会对基因本身造成永久性改变。

  2018年4月,美国Salk研究所Patrick Hsu课题组和Arbor生物技术公司分别报道了一种新型Cas效应蛋白,属于第二大类VI型RNA依赖的核糖核酸酶(RNase),并命名为Cas13d,该蛋白可做为一种强大RNA编辑工具用于纠正痴呆症患者细胞中引起疾病的蛋白质失衡【3,4】。与VI型其他成员类似,Cas13d具有两个HEPN(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding)结构域,蛋白自身可以加工pre-crRNA成为成熟的crRNA,结合靶RNA可以激活其RNase活性。虽然,Cas13d在功能上与其家族成员Cas13a-c具有一定的相似性,但是Cas13d具备一些独特之处。首先,Cas13d的蛋白序列平均长度为930个氨基酸残基,在同类蛋白中明显偏小(比其家族成员Cas13a-c小20%,比Cas9小33%),使它更容易包装到容量有限的应用载体中(比如adeno-associated virus, AAV);其次,除了两个HEPN结构域之外,Cas13d与其他Cas13家族成员之间没有明显的序列相似性;另外,在切割靶RNA时,Cas13d的靶RNA序列两端都无须PFS(protospacer flanking sequence);此外,含有WYL结构域的辅助蛋白可以增强Cas13d的底物酶切活性。因此,Cas13d更有潜力作为一种可操控的RNA结合模块,有效靶向细胞内的RNA转录物,为转录组工程和疾病治疗提供了一个通用平台。2018年9月,美国Salk研究所Patrick Hsu课题组和Dmitry Lyumkis课题组合作,利用低温电镜技术率先报道了惰性真杆菌Eubacterium siraeum Cas13d(EsCas13d)不同功能状态下的复合物冷冻电镜结构【5】。

  本研究中,欧阳松应教授课题组解析了uncultured Ruminococcus sp. Cas13d(UrCas13d)和crRNA二元复合物1.86Å高分辨率的晶体结构,并开展了相应的功能实验【1】。发现在UrCas13d-crRNA二元复合物中,成熟的crRNA结合在UrCas13d的紧凑双叶型结构所形成的通道内,两个水合镁离子对于稳定crRNA repeat region的构象发挥着重要作用;其中一个五水合镁离子通过多个氢键稳定crRNA repeat region的构象,将与该水合镁离子直接相互作用的氨基酸残基突变,发现靶RNA切割活性显著降低。进一步的实验表明,二价金属离子对于pre-crRNA加工不是必需的,但对于Cas13d的靶RNA切割是至关重要的;与Cas13家族其他成员的研究结果相比所不同的是,UrCas13d蛋白加工pre-crRNA的酶活性中心位于HEPN-2结构域上,其氨基酸残基R802和K905对于pre-crRNA切割是极其重要的;crRNA repeat region的核苷酸U(-8)-C(-1)的序列和结构被UrCas13d特异性识别,该区域的核酸序列和三维结构对于靶RNA的切割是必需的;在二元复合物中,crRNA repeat region的核苷酸U(-24)-A(-13)暴露于环境溶剂中,删除该区域内四个Watson-Crick碱基对(base pair)既不改变UrCas13d的pre-crRNA加工能力也不改变其靶RNA切割能力;针对UrCas13d两个HEPN结构域上靶RNA切割关键位点R288A或H828A,突变体蛋白足以破坏蛋白对靶RNA切割活性。此外,通过crRNA spacer region和靶RNA之间的错配耐受性实验,研究发现spacer region的两个子区域(an internal and a 3′-end region)与靶RNA之间的正确碱基配对对于靶RNA切割是必需的。

  图3. UrCas13d参与pre-crRNA加工及靶RNA切割的酶活性位点.(a)参与pre-crRNA加工的UrCas13d酶活性位点示意图;(b)野生型UrCas13d及可能参与pre-crRNA加工的UrCas13d突变体加工pre-crRNA的尿素变性凝胶电泳检测结果;(c)切割靶RNA的UrCas13d酶活性位点示意图;(d)crRNA与靶RNA之间错配耐受性的示意图;(e)crRNA与靶RNA错配耐受性的尿素变性凝胶电泳检测结果。

  福建师范大学生命科学学院及南方生物医学研究中心为本研究成果的第一单位,欧阳松应教授为本文的独立通讯作者,副研究员张博博士和研究生叶阳苗为本文的共同第一作者,上海同步辐射光源(SSRF)BL-17U1对该研究提供了重要的技术支持。

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